MICROBIOLOGIA Y BACTERIOLOGÍA

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lunes, 29 de julio de 2013

PROTOCOLO DE DETECCIÓN DE INHIBIDORES EN PIENSOS USANDO ECLIPSE 100 DE ZEU-INMUNOTEC


TEST DE DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN CEREALES Y PIENSOS CON ECLIPSE 100 O SCREENING PLUS:

Protocolo de extracción :
1.Se realizará una homogenización del pienso (sin necesidad de moler ni manipular).
2.Pesada de 0, 2 a 1 gramos de pienso según sea medicado o blanco.
3.Disolver en 100 mililítros de buffer o 20 de ese mismo tampón 
 ( buffer de extracción ) según el pienso.
 2ª dilución de medicados 1/10 buffer.
4.Agitar en Multimix ( agitador magnético ) o similar durante 2 a 3 horas. RPM 600.
5.Cesar la agitación y analizar sin esperar los 5 minutos.
6.Tomar una alícuota de 100 microlitros para el análisis. Realizar por duplicado. Sellar. 
7.Tras la inoculación de cada pocillo, incubar 1 hora a temperatura ambiente.
8.Lavar tres veces y secar. Sellar bien la tira de pocillos!!!.
9.Incubar a 65ºC durante 2 horas y diez o  y cuarto.
10. Lectura de resultados. Serán positivos todos los que NO presenten un  viraje a amarillo , desde grises a azul-violeta ( existencia de algún tono azul en el pocillo ).

Antimicrobiano en Pienso( mg/ Kg ) = [ LD en buffer (ug/ L) x Vol. Diluyente ( L )] / Peso pienso
 ( g)

Precauciones
NO PROLONGAR MAS DE 2, 15 HRS EL TIEMPO DE LA 2ª INCUBACIÓN (mirar certificado técnico, normalmente 2,10 hrs o poner un blanco).
Siempre que se prepare un buffer nuevo, ajustar el pH a 7, 4 – 7, 7 e introducirlo como estándar cero y comprobar que está libre de inhibidores.
Siempre que se cambie de tipos de piensos se debe replantear el tipo de dilución a utilizar para no tener problemas de interferencias de inhibidores no antibióticos ( sólo los ha habido con piensos con gran cantidad de tampón ). En principio con esas diluciones no debe haber problema.
El factor a aplicar será 20 o 5000 según el pienso ( blanco o medicado ).
Se puede realizar en caso de necesitar mayor sensibilidad, una dilución 1/10 con el mismo buffer (y mediar una centrifugación a por ejemplo 2300 RPM)aunque también aumenta el riesgo de interferencias.
El buffer fosfato no puede ser sustituido por agua destilada teniendo en cuenta que puede de manera inaceptable la sensibilidad para los inhibidores.
Sensibilidades: Menor de 2000 PPB en el caso de clortetraciclina y alrededor de 2000 , usando el buffer citado en el caso de sulfadiacina para pienso blanco.

Para pienso medicado se está revisando la recta de corte.
Para otros antibióticos consultar la tabla de sensibilidades del kit.
Con agua destilada nos iríamos a una sensibilidad de 10.000 PPB o más para SDZ, según las diluciones seriadas realizadas.
El tiempo de agitación se puede reducir comprobando siempre que los resultados son equivalentes.
En caso de positivos a dilución 1/ 20 se debería repetir para confirmar a 1/ 50 para evitar problemas de mejor sensibilidad con LDG.
Este protocolo es propio y ya ha sido estandarizado. Ver ficha técnica Eclipse de ZEU de mayo 2005. 
  
PROTOCOLO PARA TWIN SENSOR:
Dilución del pienso en leche entera  1:50 o 1:100 , agitar como en el caso de Eclipse 100 y realizar el análisis según la técnica del kit. Comprobar la ausencia de residuos en la leche utilizada realizando un blanco por cada litro comprado.