MICROBIOLOGIA Y BACTERIOLOGÍA

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miércoles, 16 de octubre de 2013

DETECCIÓN DE LEGIONELLA PNEUMOPHILA



El género Legionella pertenece a la familia Legionellaceae, orden Legionellales, clase Gammaproteobacteria, filo Proteobacteria. Bacilos delgados gram-negativos pleomórficos, aerobios, catalasa y oxidasa positivos. Varias especies son patógenas de humanos, la principal es L. pneumophila, otras son: L.micdadei (agente de la neumonía de Pittsburg), L.bozentanii, etc.
No se tiñe con la tinción de Gram, pero se puede observar mediante tinciones argénticas (tinción de Dieterle o Jiménez) o con inmunofluorescencia directa.
Es un parásito intracelular de amebas y otros protozoos de agua dulce, en los que utiliza un mecanismo de multiplicación intracelular similar al usado en las células del organismo humano, siendo capaz de resistir en los fagosomas de macrófagos alveolares. Es capaz de sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones fisico-químicas, multiplicándose entre 20ºC y 45ºC, con temperatura óptima a 35-37ºC.
No crece en medios comunes pero sí en medios especiales con sales de hierro y aminoácidos, los cuales utiliza como fuente de carbón, el medio de elección es el medio BCYEα (extracto de levadura, L-cisteína, pirofosfato férrico y alfa-cetoglutarato) al que se le pueden añadir antibióticos (glicina, vancomicina, polimixina y cicloheximida) llamándose medio GVPC.
Epidemiología: Forma parte de la microbiota natural del suelo y ecosistemas acuáticos (aguas superficiales, como lagos, ríos, estanques). Desde estos reservorios naturales la bacteria puede colonizar 1os sistemas de abastecimiento de las ciudades y, a través de la red de distribución de agua, se incorpora a los sistemas de agua sanitaria (fría o caliente) u otros sistemas que requieren agua para funcionar como las torres de refrigeración. La infección se produce por la propagación de la bacteria en aerosoles producidos desde sistemas de distribución de agua potable, duchas, conductos de aire acondicionado, etc. contaminados, al aparato respiratorio. La infección puede adquirirse tanto en el ámbito comunitario como hospitalario.
Cuadros clínicos: Es el agente etiológico de la legionelosis que se presenta en dos formas clínicas diferenciadas: la infección pulmonar o Enfermedad del Legionario (neumonía por Legionella), que se caracteriza por neumonía atípica con fiebre alta, tos no productiva, cefalea, bronconeumonía, manifestaciones neurológicas, diarrea y bradicardia; y la forma no neumónica, llamada Fiebre de Pontiac, un síndrome febril agudo y de pronóstico leve.
Tratamiento de muestras:
La recogida de muestras para el aislamiento de Legionella, se establece en el ANEXO 6 del Real Decreto 865/2003, de 27 de julio, por el que se establecen los criterios higiénico-sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. Detección de Legionella pneumophila según la Norma ISO 11731 (1998): filtrar 1L de agua de muestra a través de una rampa de filtración con un filtro de 0,22 micras de diámetro. Lavar el filtro y sembrar en agar BCYEα (parte de la muestra se descontamina por calentamiento antes de sembrar en agar BCYEα). Resembrar las colonias crecidas en agar BCYE-cys (sin L-cisteína) para comprobar la ausencia de crecimiento. Una vez comprobado esto se confirman las colonias con tinción de gram (para observar bacilos gram negativos) y tinción con anticuerpos anti-legionella pneumophila fluorescentes.
La detección y enumeración de Legionella pneumophila en aguas se basa en el hecho de que las especies del género Legionella pueden crecer en 48 horas, al menos, en agar BCYEα ("Buffered Charcoal Yeast Extract", Extracto de levadura con carbón activo tamponado) que contenga L-Cisteína y Hierro (III) formando colonias normalmente blancas y en ocasiones moradas, azules o verde lima.
1ª MUESTRA: El primer paso en la detección de Legionella consiste en la concentración de la muestra. Para ello se filtran al menos 1000 mL de agua en rampa de vacío a través de un filtro de 0,22 µm. El filtro se recoge en un matraz con 10 mL de muestra, se agita durante 30 minutos y se siembra en Agar BCYEα(con L-cisteína) por extensión en superficie.
2ª MUESTRA: Parte del filtrado (muestra concentrada) se descontamina calentándolo en baño María a 60ºC durante 3 minutos si se han tomado 0,5 mL o a 50ºC durante 30 minutos si se toman 2 mL. La muestra calentada se siembra en Agar BCYEα(con L-cisteína) y BCYE-cys (sin L-cisteína) por extensión en superficie.
Todas las placas de los medios BCYEα y BCYE-cys se incuban a 37ºC durante 15 días en atmósfera de CO2 al 4,5% lo que inhibe el crecimiento del meningococo.
Las colonias blanquecinas que aparecen se resiembran en Agar BCYEα, en Agar BCYE-cys y Agar Sangre en las mismas condiciones.

Se consideran sospechosas las colonias que crecen en Agar BCYEα pero no en Agar Sangre ni en Agar BCYE-cys.
Las colonias sospechosas se confirman mediante la tinción de Gram, la prueba de la hidrólisis del hipurato y tinción por inmunofluorescencia directa o test de aglutinación de látex.
Legionella pneumophila es un bacilo gram negativo, aunque se tiñe mal por la tinción de Gram y en ocasiones hay que recurrir a tinciones especiales como la de Giménez o Dieterle.
Legionella pneumophila, a diferencia de otras especies de Legionella hidroliza el hipurato sódico, lo que se pone de manifiesto añadiendo ninhidrina después de incubar el microorganismo en a 37ºC durante dos horas.
Tinción con anticuerpos marcados. Anticuerpo marcado con Fluoreceína adherido al bacilo Legionella.
Los detalles sobre cómo limpiar, desinfectar y mantener las instalaciones a que nos estamos refiriendo se encuentran en el informe UNE 100-030-94 "Guía para la prevención de la Legionella en instalaciones".
Otro tipo de medidas sanitarias sobre la procedencia de vigilar, controlar microbiológicamente e incluso clausurar instalaciones implicadas en la aparición de casos o brotes, son competencia de la autoridad sanitaria y han sido ampliamente desarrolladas en la reciente publicación del Ministerio de Sanidad y Consumo "Recomendaciones para la prevención y control de legionelosis" Secretaría General Técnica del Ministerio de Sanidad y Consumo. 1999. ISBN 84-7670-507-7.
Existen preparados para diferenciar el serogrupo 1 del resto (2-14). El 80% de los casos son debídos al serotipo 1 de L. pneumophila. Le siguen en orden de frecuencia los serotipos 3 y 6 de L pneumophila y L. micdadei.
En depósitos de agua caliente y fría (acumuladores, calentadores, calderas, tanques, cisternas, aljibes, pozos, etc.) se tomará aproximadamente un litro de agua de cada uno, preferiblemente de la parte baja del depósito, recogiendo, si existieran, materiales sedimentados. Medir temperatura del agua y cantidad de cloro libre y anotar.
Se tomará aproximadamente un litro de agua, recogiendo primero una pequeña cantidad (unos 100 ml), para después rascar el grifo o ducha con una torunda que se incorporará en el mismo envase y recoger el resto de agua (hasta aproximadamente un litro) arrastrando los restos del rascado. Medir temperatura del agua y cantidad de cloro libre.
En torres de refrigeración, condensadores evaporativos u otros aparatos de refrigeración que utilicen agua en su funcionamiento y generen aerosoles, se tomará aproximadamente un litro de agua de la parte baja de la torre y de la bandeja, procurando recoger restos de suciedad, incluso rascando posibles incrustaciones de la pared. Medir temperatura del agua y cantidad de cloro libre.
Dependiendo del estudio epidemiológico, se tomarán muestras de otras instalaciones como piscinas, pozos, sistemas de riego, fuentes, instalaciones termales, así como de otros equipos que “aerosolicen” agua, como nebulizadores, humidificadores o equipos de terapia personal. En estos casos el número de puntos a tomar muestra de agua dependerá del tipo de instalación y su accesibilidad, y el volumen de agua a tomar dependerá de la cantidad de agua utilizada en su funcionamiento. En cualquier caso medir temperatura y cloro.
Las muestras deberán recogerse en envases estériles, adecuados para evitar que se rompan o se vierta su contenido en el transporte, con cierre hermético, a los que se les añadirá un neutralizante (tiosulfato sódico). Deberán llegar al laboratorio lo antes posible, manteniéndose a temperatura ambiente y evitando temperaturas extremas.