MICROBIOLOGIA Y BACTERIOLOGÍA

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lunes, 29 de julio de 2013

CONTROL DE RESIDUOS EN CARNES Y PIENSOS DENTRO DE APPCC

En el autocontrol de residuos en carne, incluido en el sistema APPCC, debemos distinguir entre dos tipos de residuos químicos, los que están en la categoria de prohibidos ( clenbuterol, cloranfenicol, ...) y los que son autorizados pero tienen unos límites máximos , LMR, normalmente 100 o más PPB ( partes por billon), pero depende de cada resíduo, todo esto lo marca la CE.
Es evidente que todo lo producido no se puede muestrear, pero interesa que  dentro de nuestras posibilidades se realicen el mayor número de muestras posibles para que probabilísticamente nuestro error (no detectar muestras positivas) sea próximo a cero, por todo ello el precio unitario de análisis debe ser el menor posible.
En mi caso en el laboratorio, descartamos técnicas cromatográficas por varias razones, la principal, el aparataje es carísimo, el método de extracción varía con cada residuo a analizar, y según los casos era más rentable externalizar muestras.
Para casos de análitica rápida y sensible (en el caso del clenbuterol, 3 horas de analisis y sensibilidades menores de 1 PPB, utilizando matrices como orina, hígado o incluso pelo), la tecnología utilizada era ELISA que es un método inmunoenzimático con prestaciones similares a la técnica oficial , sea cromatografía de gases-masas o HPLC.Se utilizó también para control de otras sustancias prohibidas como hormonas y sobre todo para control de otros productos como corticoides y sulfamidas. Las muestras eran proporcionadas por el SVO. Se hacían pools o mezclas de 10 muestras de la misma partida / un análisis de bovíno.
Se llegaron a 800 muestras/año de betaagonistas y 400 de corticos.
Para el control de inhibidores o antibióticos, se optó por utilizar un sistema biológico basado en la inhibición del crecimiento de una bacteria del género Bacillus ( Bacillus stearothermophilus ) ya que con las técnicas oficiales, buscar un inhibidor concreto en una muestra, era como buscar una aguja en un pajar. Era más fácil hacer un screening de muchas muestras y sólo las positivas someterlas a posterior análisis por ELISA o por cromatografia (análisis externos). A partir de ello colaboramos en dos estudios de investigación, para el INIA y la DGA junto a la facultad de Veterinaria de Zaragoza , CITA y ZEU INMUNOTEC, empresa fabricante de test de detección de inhibidores.
Es de destacar que tras un problema que tuvimos con un residuo de inhibidor autorizado (Sulfadiazina), conseguimos adaptar un kit que se empleaba para leche, en la detección de inhibidores en pienso blanco, con unas sensibilidades superiores al método oficial ( HPLC) y solucionar así un problema dentro de la producción de pienso.
En ELISA las marcas utilizadas fueron  TECNA, RIEDEL DEHAEN (sin duda el mejor para betaagonistas)  y en menor medida BIOFARM.
Aunque las extracciones de las muestras dependen de la marca y del residuo a estudiar, siempre son más sencillas y baratas que el método oficial (cromatográfico) y de similar sensibilidad.  

PROTOCOLO DE DETECCIÓN DE INHIBIDORES EN PIENSOS USANDO ECLIPSE 100 DE ZEU-INMUNOTEC


TEST DE DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN CEREALES Y PIENSOS CON ECLIPSE 100 O SCREENING PLUS:

Protocolo de extracción :
1.Se realizará una homogenización del pienso (sin necesidad de moler ni manipular).
2.Pesada de 0, 2 a 1 gramos de pienso según sea medicado o blanco.
3.Disolver en 100 mililítros de buffer o 20 de ese mismo tampón 
 ( buffer de extracción ) según el pienso.
 2ª dilución de medicados 1/10 buffer.
4.Agitar en Multimix ( agitador magnético ) o similar durante 2 a 3 horas. RPM 600.
5.Cesar la agitación y analizar sin esperar los 5 minutos.
6.Tomar una alícuota de 100 microlitros para el análisis. Realizar por duplicado. Sellar. 
7.Tras la inoculación de cada pocillo, incubar 1 hora a temperatura ambiente.
8.Lavar tres veces y secar. Sellar bien la tira de pocillos!!!.
9.Incubar a 65ºC durante 2 horas y diez o  y cuarto.
10. Lectura de resultados. Serán positivos todos los que NO presenten un  viraje a amarillo , desde grises a azul-violeta ( existencia de algún tono azul en el pocillo ).

Antimicrobiano en Pienso( mg/ Kg ) = [ LD en buffer (ug/ L) x Vol. Diluyente ( L )] / Peso pienso
 ( g)

Precauciones
NO PROLONGAR MAS DE 2, 15 HRS EL TIEMPO DE LA 2ª INCUBACIÓN (mirar certificado técnico, normalmente 2,10 hrs o poner un blanco).
Siempre que se prepare un buffer nuevo, ajustar el pH a 7, 4 – 7, 7 e introducirlo como estándar cero y comprobar que está libre de inhibidores.
Siempre que se cambie de tipos de piensos se debe replantear el tipo de dilución a utilizar para no tener problemas de interferencias de inhibidores no antibióticos ( sólo los ha habido con piensos con gran cantidad de tampón ). En principio con esas diluciones no debe haber problema.
El factor a aplicar será 20 o 5000 según el pienso ( blanco o medicado ).
Se puede realizar en caso de necesitar mayor sensibilidad, una dilución 1/10 con el mismo buffer (y mediar una centrifugación a por ejemplo 2300 RPM)aunque también aumenta el riesgo de interferencias.
El buffer fosfato no puede ser sustituido por agua destilada teniendo en cuenta que puede de manera inaceptable la sensibilidad para los inhibidores.
Sensibilidades: Menor de 2000 PPB en el caso de clortetraciclina y alrededor de 2000 , usando el buffer citado en el caso de sulfadiacina para pienso blanco.

Para pienso medicado se está revisando la recta de corte.
Para otros antibióticos consultar la tabla de sensibilidades del kit.
Con agua destilada nos iríamos a una sensibilidad de 10.000 PPB o más para SDZ, según las diluciones seriadas realizadas.
El tiempo de agitación se puede reducir comprobando siempre que los resultados son equivalentes.
En caso de positivos a dilución 1/ 20 se debería repetir para confirmar a 1/ 50 para evitar problemas de mejor sensibilidad con LDG.
Este protocolo es propio y ya ha sido estandarizado. Ver ficha técnica Eclipse de ZEU de mayo 2005. 
  
PROTOCOLO PARA TWIN SENSOR:
Dilución del pienso en leche entera  1:50 o 1:100 , agitar como en el caso de Eclipse 100 y realizar el análisis según la técnica del kit. Comprobar la ausencia de residuos en la leche utilizada realizando un blanco por cada litro comprado.

lunes, 15 de julio de 2013

CATÁLOGO DE PRODUCTOS DE MICROBIOLOGÍA DE MICROKIT

Os adjunto a la foto el catálogo de productos de una empresa española con sede en Madrid (Valdemorillo) y referencia en el sector.
Es interesante por su amplia cantidad de productos, más de mil. He utilizado algunos de ellos como laminocultivos, TSI en tubos, neogran, Antibiotic test...
El catálogo es muy denso y con algún que otro error. Abusa de signos lo cual no lo hace muy agradable de leer y tiene cosas como  lo del muñequito (al menos en la versión en papel) que es cuando menos naíf.
Aún con todo es interesante para tener soluciones, gracias a su amplísima gama de productos.